Mit dem nunmehr funktionierenden Thermocycler soll eine DNA Analyse durchgeführt werden.

Protokolle:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf

Vorbereitungen: Mix aus 9 RAPD Primern hergestellt

-Mit Wattestäbchen Schleimhautzellen entnehmen -in einem mit Wasser gefüllten Microtube ausschütteln -5min bei 4000rpm zentrifugieren -Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet -Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen ¹⁾

• 100µl 10x TAE Puffer auf 3ml mit Wasser verdünnnen.
• 60mg SDS hinzufügen.
• Davon dann 400µl nehmen.

-5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad)

Magnetische Dna Beads vorbereiten:

-Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen -Magnet an die Seite des Microtubes halten -60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind -Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen -Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen

DNA ausfällen, an Beads binden, waschen:

-400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben -Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen -2-10 Minuten warten -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden. -Flüssigkeit absaugen -800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen -Waschvorgang midnestens 2x wiederholen

DNA in Lösung bringen:

-20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen -2-10 minuten warten, mehrmals mischen -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden -Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube

DNA einfärben(optional):

-zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2) -Vortexen -Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA -Vortexen -Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70% -Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. -Überstand sorgfältig abnehmen -Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. -Überstand sorgfältig abnehmen -Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln (ca. 10 sec.) -Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen -Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.) -Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer)

PCR:

-2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen -30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen

Gel-Elektrophorese:

-1X TAE Puffer für Gelelektrophorese (500 ml)

• 2,42g Tris in 250ml dH20 lösen
• 0,185g EDTA darin lösen
• 0,57ml Eisessig (17,4M) zugeben
• Auf 500ml mit dH2O auffüllen

-Agarosegel (1%) für Kammer(50ml) herstellen

• 50ml von 1X TAE Puffer entnehmen
• 0,5g Agarose zugeben und in Mikrowelle aufschmelzen

-in Kammer gießen -Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen -DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen -Box anschließen und laufen lassen