OLGA

**DNA Analyse**

Mit dem nunmehr funktionierenden Thermocycler soll eine DNA Analyse durchgeführt werden.

Protokolle:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf


Zellen sammeln und auflösen:

-Mit Wattestäbchen Schleimhautzellen entnehmen

-in einem mit Wasser gefüllten Microtube ausschütteln

-5min bei 4000rpm zentrifugieren

-Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet -Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen 1)

  • 100µl 10x TAE Puffer auf 3ml mit Wasser verdünnnen.
  • 60mg SDS hinzufügen.
  • Davon dann 400µl nehmen.

-5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad)

Magnetische Dna Beads vorbereiten:

-Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen

-Magnet an die Seite des Microtubes halten

-60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind

-Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen

-Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen

DNA ausfällen, an Beads binden, waschen:

-400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben

-Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen

-2-10 Minuten warten

-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden.

-Flüssigkeit absaugen

-800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen

-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen

-Waschvorgang midnestens 2x wiederholen

DNA in Lösung bringen:

-20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen

-2-10 minuten warten, mehrmals mischen

-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden

-Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube

DNA einfärben(optional):

-zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2)

-Vortexen

-Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA

-Vortexen

-Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70%

-Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.

-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.

-Überstand sorgfältig abnehmen

-Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol

-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.

-Überstand sorgfältig abnehmen

-Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln (ca. 10 sec.)

-Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen

-Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.)

-Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer)

PCR:

-2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen

-30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen

Gel-Elektrophorese:

-1X TAE Puffer für Gelelektrophorese (500 ml)

  • 2,42g Tris in 250ml dH20 lösen
  • 0,185g EDTA darin lösen
  • 0,57ml Eisessig (17,4M) zugeben
  • Auf 500ml mit dH2O auffüllen

-Agarosegel (1%) für Kammer(50ml) herstellen

  • 50ml von 1X TAE Puffer entnehmen
  • 0,5g Agarose zugeben und in Mikrowelle aufschmelzen

-in Kammer gießen

-Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen

-DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen

-Box anschließen und laufen lassen


1)
50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS
realraum Graz, Brockmanngasse 15, 8010 Graz, realraum - Verein für Technik in Kultur und Gesellschaft
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  • Last modified: 2015-09-23 02:06
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