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--- olga:projekte_dna_analyse [2013-12-10 18:39]
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+++ olga:projekte_dna_analyse [2015-09-23 02:06] (current)
xro
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 Mit dem nunmehr funktionierenden Thermocycler soll eine DNA Analyse durchgeführt werden.
-**Vorbereitungen:** Mix aus 9 Primern hergestellt
+**Protokolle:**{{:olga:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf|}}
+\\
+=== Zellen sammeln und auflösen:===
+-Mit Wattestäbchen Schleimhautzellen entnehmen
+-in einem mit Wasser gefüllten Microtube ausschütteln
+-5min bei 4000rpm zentrifugieren
+-Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet
+-Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen ((50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS))
+    *100µl 10x TAE Puffer auf 3ml mit Wasser verdünnnen.
+    *60mg SDS hinzufügen.
+    *Davon dann 400µl nehmen.
+-5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad)
+=== Magnetische Dna Beads vorbereiten: ===
+-Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen
+-Magnet an die Seite des Microtubes halten
+-60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind
+-Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen
+-Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen
+=== DNA ausfällen, an Beads binden, waschen: ===
+-400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben
+-Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen
+-2-10 Minuten warten
+-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden.
+-Flüssigkeit absaugen
+-800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen
+-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen
+-Waschvorgang midnestens 2x wiederholen
+=== DNA in Lösung bringen: ===
+-20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen
+-2-10 minuten warten, mehrmals mischen
+-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden
+-Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube
+=== DNA einfärben(optional): ===
+-zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2)
+-Vortexen
+-Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA
+-Vortexen
+-Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70%
+-Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
+-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
+-Überstand sorgfältig abnehmen
+-Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol
+-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
+-Überstand sorgfältig abnehmen
+-Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln (ca. 10 sec.)
+-Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen
+-Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.)
+-Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer)
+=== PCR: ===
+-2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen
+-30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen
+=== Gel-Elektrophorese: ===
+-1X TAE Puffer für Gelelektrophorese (500 ml)
+   *2,42g Tris in 250ml dH20 lösen
+   *0,185g EDTA darin lösen
+   *0,57ml Eisessig (17,4M) zugeben
+   *Auf 500ml mit dH2O auffüllen
+-Agarosegel (1%) für Kammer(50ml) herstellen
+  *50ml von 1X TAE Puffer entnehmen
+  *0,5g Agarose zugeben und in Mikrowelle aufschmelzen
+-in Kammer gießen
+-Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen
+-DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen
+-Box anschließen und laufen lassen
+{{tag>project olga dna pcr}}

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