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humpel
+++ olga:projekte_dna_analyse [2015-09-16 12:41]
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 **Protokolle:**{{:olga:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf|}}
-**Vorbereitungen:** Mix aus 9 RAPD Primern hergestellt
+\\
+=== Zellen sammeln und auflösen:===
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 -5min bei 4000rpm zentrifugieren
 -Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet
 -Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen ((50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS))
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     *60mg SDS hinzufügen.
     *Davon dann 400µl nehmen.
 -5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad)
-Magnetische Dna Beads vorbereiten:
+=== Magnetische Dna Beads vorbereiten: ===
 -Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen
 -Magnet an die Seite des Microtubes halten
 -60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind
 -Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen
 -Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen
-DNA ausfällen, an Beads binden, waschen:
+=== DNA ausfällen, an Beads binden, waschen: ===
 -400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben
 -Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen
 -2-10 Minuten warten
 -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden.
 -Flüssigkeit absaugen
 -800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen
 -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen
 -Waschvorgang midnestens 2x wiederholen
-DNA in Lösung bringen:
+=== DNA in Lösung bringen: ===
 -20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen
 -2-10 minuten warten, mehrmals mischen
 -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden
 -Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube
-DNA einfärben(optional):
+=== DNA einfärben(optional): ===
 -zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2)
 -Vortexen
 -Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA
 -Vortexen
 -Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70%
 -Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
 -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
 -Überstand sorgfältig abnehmen
 -Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol
 -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
 -Überstand sorgfältig abnehmen
--Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln
-(ca. 10 sec.)
+-Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln (ca. 10 sec.)
 -Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen
 -Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.)
--Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles
-Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer)
+-Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer)
-PCR:
+=== PCR: ===
 -2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen
 -30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen
-Gel-Elektrophorese:
+=== Gel-Elektrophorese: ===
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 -in Kammer gießen
 -Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen
 -DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen
 -Box anschließen und laufen lassen

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