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**DNA Analyse**
Mit dem nunmehr funktionierenden Thermocycler soll eine DNA Analyse durchgeführt werden.
Protokolle:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf
Zellen sammeln und auflösen:
-Mit Wattestäbchen Schleimhautzellen entnehmen
-in einem mit Wasser gefüllten Microtube ausschütteln
-5min bei 4000rpm zentrifugieren
-Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet -Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen 1)
- 100µl 10x TAE Puffer auf 3ml mit Wasser verdünnnen.
- 60mg SDS hinzufügen.
- Davon dann 400µl nehmen.
-5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad)
Magnetische Dna Beads vorbereiten:
-Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen
-Magnet an die Seite des Microtubes halten
-60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind
-Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen
-Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen
DNA ausfällen, an Beads binden, waschen:
-400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben
-Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen
-2-10 Minuten warten
-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden.
-Flüssigkeit absaugen
-800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen
-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen
-Waschvorgang midnestens 2x wiederholen
DNA in Lösung bringen:
-20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen
-2-10 minuten warten, mehrmals mischen
-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden
-Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube
DNA einfärben(optional):
-zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2)
-Vortexen
-Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA
-Vortexen
-Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70%
-Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min.
-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
-Überstand sorgfältig abnehmen
-Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol
-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min.
-Überstand sorgfältig abnehmen
-Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln (ca. 10 sec.)
-Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen
-Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.)
-Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer)
PCR:
-2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen
-30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen
Gel-Elektrophorese:
-1X TAE Puffer für Gelelektrophorese (500 ml)
- 2,42g Tris in 250ml dH20 lösen
- 0,185g EDTA darin lösen
- 0,57ml Eisessig (17,4M) zugeben
- Auf 500ml mit dH2O auffüllen
-Agarosegel (1%) für Kammer(50ml) herstellen
- 50ml von 1X TAE Puffer entnehmen
- 0,5g Agarose zugeben und in Mikrowelle aufschmelzen
-in Kammer gießen
-Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen
-DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen
-Box anschließen und laufen lassen