Differences
This shows you the differences between two versions of the page.
Next revision | Previous revision | ||
olga:projekte_dna_analyse [2013-12-10 18:39] humpel angelegt |
olga:projekte_dna_analyse [2015-09-23 02:06] (current) xro |
||
---|---|---|---|
Line 4: | Line 4: | ||
Mit dem nunmehr funktionierenden Thermocycler soll eine DNA Analyse durchgeführt werden. | Mit dem nunmehr funktionierenden Thermocycler soll eine DNA Analyse durchgeführt werden. | ||
- | **Vorbereitungen:** Mix aus 9 Primern hergestellt | + | **Protokolle:**{{:olga:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf|}} |
+ | |||
+ | |||
+ | \\ | ||
+ | |||
+ | === Zellen sammeln und auflösen:=== | ||
+ | |||
+ | |||
+ | -Mit Wattestäbchen Schleimhautzellen entnehmen | ||
+ | |||
+ | -in einem mit Wasser gefüllten Microtube ausschütteln | ||
+ | |||
+ | -5min bei 4000rpm zentrifugieren | ||
+ | |||
+ | -Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet | ||
+ | -Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen ((50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS)) | ||
+ | *100µl 10x TAE Puffer auf 3ml mit Wasser verdünnnen. | ||
+ | *60mg SDS hinzufügen. | ||
+ | *Davon dann 400µl nehmen. | ||
+ | |||
+ | -5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad) | ||
+ | |||
+ | === Magnetische Dna Beads vorbereiten: === | ||
+ | |||
+ | |||
+ | -Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen | ||
+ | |||
+ | -Magnet an die Seite des Microtubes halten | ||
+ | |||
+ | -60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind | ||
+ | |||
+ | -Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen | ||
+ | |||
+ | -Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen | ||
+ | |||
+ | |||
+ | === DNA ausfällen, an Beads binden, waschen: === | ||
+ | |||
+ | |||
+ | -400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben | ||
+ | |||
+ | -Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen | ||
+ | |||
+ | -2-10 Minuten warten | ||
+ | |||
+ | -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden. | ||
+ | |||
+ | -Flüssigkeit absaugen | ||
+ | |||
+ | -800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen | ||
+ | |||
+ | -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen | ||
+ | |||
+ | -Waschvorgang midnestens 2x wiederholen | ||
+ | |||
+ | === DNA in Lösung bringen: === | ||
+ | |||
+ | |||
+ | -20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen | ||
+ | |||
+ | -2-10 minuten warten, mehrmals mischen | ||
+ | |||
+ | -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden | ||
+ | |||
+ | -Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube | ||
+ | |||
+ | |||
+ | === DNA einfärben(optional): === | ||
+ | |||
+ | |||
+ | -zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2) | ||
+ | |||
+ | -Vortexen | ||
+ | |||
+ | -Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA | ||
+ | |||
+ | -Vortexen | ||
+ | |||
+ | -Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70% | ||
+ | |||
+ | -Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. | ||
+ | |||
+ | -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. | ||
+ | |||
+ | -Überstand sorgfältig abnehmen | ||
+ | |||
+ | -Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol | ||
+ | |||
+ | -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. | ||
+ | |||
+ | -Überstand sorgfältig abnehmen | ||
+ | |||
+ | -Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln (ca. 10 sec.) | ||
+ | |||
+ | -Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen | ||
+ | |||
+ | -Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.) | ||
+ | |||
+ | -Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer) | ||
+ | |||
+ | |||
+ | === PCR: === | ||
+ | |||
+ | |||
+ | -2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen | ||
+ | |||
+ | -30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen | ||
+ | |||
+ | |||
+ | === Gel-Elektrophorese: === | ||
+ | |||
+ | |||
+ | |||
+ | -1X TAE Puffer für Gelelektrophorese (500 ml) | ||
+ | *2,42g Tris in 250ml dH20 lösen | ||
+ | *0,185g EDTA darin lösen | ||
+ | *0,57ml Eisessig (17,4M) zugeben | ||
+ | *Auf 500ml mit dH2O auffüllen | ||
+ | |||
+ | -Agarosegel (1%) für Kammer(50ml) herstellen | ||
+ | *50ml von 1X TAE Puffer entnehmen | ||
+ | *0,5g Agarose zugeben und in Mikrowelle aufschmelzen | ||
+ | |||
+ | -in Kammer gießen | ||
+ | |||
+ | -Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen | ||
+ | |||
+ | -DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen | ||
+ | |||
+ | -Box anschließen und laufen lassen | ||
+ | |||
+ | {{tag>project olga dna pcr}} |
realraum Graz, Brockmanngasse 15, 8010 Graz, realraum - Verein für Technik in Kultur und Gesellschaft