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olga:olgaplasmidminipraep [2020-04-10 04:36] danield [DNA Plasmid Präparation (MiniPräp)] |
olga:olgaplasmidminipraep [2020-06-25 20:07] (current) danield |
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| - | ==== DNA Plasmid Präparation (MiniPräp) ==== | + | ==== DNA Plasmidpräparation (Minipräp) ==== |
| - | Die Plasmidpräparation (auch Plasmidisolierung) ist eine molekularbiologische Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA. Die Bezeichnung "Mini-" stammt von der minimalen Menge mit denen gearbeitet wird. Es gibt nämlich auch die Midi- oder Maxi-Präp mit größeren Volumina. | + | Die Plasmidpräparation (auch Plasmidisolierung) ist eine molekularbiologische Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA. Die Bezeichnung "Mini-" stammt von der minimalen Menge mit denen gearbeitet wird. Es gibt nämlich auch die Midi- oder Maxipräp mit größeren Volumina. |
| - | Im OLGA gibt es ein fix fertiges DIY MiniPräp Kit mit den Lösungen und der Anleitung. Dieses kann/darf/soll ein jeder benutzen. | + | Im OLGA gibt es einfertiges DIY-Minipräp-Kit mit den Lösungen und der Anleitung. Dieses kann/darf/soll ein jeder benutzen. |
| [[https://galley.realraum.at/_data/i/upload/2018/12/01/20181201172452-90210fd6-me.jpg|{{https://galley.realraum.at/_data/i/upload/2018/12/01/20181201172452-90210fd6-me.jpg?300x500}}]] | [[https://galley.realraum.at/_data/i/upload/2018/12/01/20181201172452-90210fd6-me.jpg|{{https://galley.realraum.at/_data/i/upload/2018/12/01/20181201172452-90210fd6-me.jpg?300x500}}]] | ||
| - | ==== Lösungen für die Minilysatpräparation von Plasmid DNA ==== | + | ==== Lösungen für die Minilysatpräparation von Plasmid-DNA ==== |
| **Lösung I:** (400 µL) | **Lösung I:** (400 µL) | ||
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| 2) Schütteln: Lösung II bildet Schaum wegen SDS. | 2) Schütteln: Lösung II bildet Schaum wegen SDS. | ||
| - | 3) Lösung 1 bleibt übrig. | + | 3) Lösung 1 bleibt nach Ausschlussverfahren übrig. |
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| ==== Durchführung: ==== | ==== Durchführung: ==== | ||
| - | 1. Bakterien werden aus 3 ml ONC geerntet. Dazu 1,5 ml ONC in ein Eppendorfgefäß | + | 1. Bakterien werden aus 3 ml ONC geerntet. Dazu 1,5 ml ONC in ein Mikroreaktionsgefäß |
| (Eppi) füllen und 1 min x 10,000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugieren. Entfernen | (Eppi) füllen und 1 min x 10,000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugieren. Entfernen | ||
| des Überstands. Erneut 1,5 ml ONC in Eppi füllen und Zentrifugation wiederholen. | des Überstands. Erneut 1,5 ml ONC in Eppi füllen und Zentrifugation wiederholen. | ||
| Line 68: | Line 68: | ||
| 4. Zugabe von vorgekühlter (Eis!) 400 µl 2,8M Kaliumacetatlösung, pH 5,1 und gut mischen | 4. Zugabe von vorgekühlter (Eis!) 400 µl 2,8M Kaliumacetatlösung, pH 5,1 und gut mischen | ||
| - | (kippen/ invertieren), aber nicht vortexen! Es entsteht ein weißer, flockiger Niederschlag. | + | (kippen/invertieren), aber nicht vortexen! Es entsteht ein weißer, flockiger Niederschlag. |
| Das Eppi 15 min auf Eis stellen. | Das Eppi 15 min auf Eis stellen. | ||
| Line 74: | Line 74: | ||
| 6. ca. 800 µl Überstand wird ohne Flocken in ein frisches Eppi überführt, mit 600 µl | 6. ca. 800 µl Überstand wird ohne Flocken in ein frisches Eppi überführt, mit 600 µl | ||
| - | Isopropanol gemischt (kippen/ invertieren), aber nicht vortexen! | + | Isopropanol gemischt (kippen/invertieren), aber nicht vortexen! |
| 7. Zentrifugation für 15 Minuten bei 4°C und 10.000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge), um DNA | 7. Zentrifugation für 15 Minuten bei 4°C und 10.000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge), um DNA | ||
| Line 85: | Line 85: | ||
| 9. 3 µl der gelösten Plasmid DNA werden in ein neues Eppi überführt und für nachfolgende | 9. 3 µl der gelösten Plasmid DNA werden in ein neues Eppi überführt und für nachfolgende | ||
| - | Schnitt-Kontrollen bei -20°C gelagert. Eppi gut beschriften! | + | Schnittkontrollen bei -20°C gelagert. Eppi gut beschriften! |
| - | 10. 15µl der restlichen Plasmid DNA für den Restriktionsansatz verwenden und die | + | 10. 15µl der restlichen Plasmid-DNA für den Restriktionsansatz verwenden und die |
| verbleibende Plasmid DNA bei -20°C aufbewahren. Eppis gut beschriften! | verbleibende Plasmid DNA bei -20°C aufbewahren. Eppis gut beschriften! | ||
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