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--- olga:olgaplasmidminipraep [2020-04-10 04:20]
danield
+++ olga:olgaplasmidminipraep [2020-04-10 04:36]
danield [DNA Plasmid Präparation (MiniPräp)]
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-** Baustelle **
-==== DNA Plasmid Mini-Präp ====
+==== DNA Plasmid Präparation (MiniPräp) ====
+Die Plasmidpräparation (auch Plasmidisolierung) ist eine molekularbiologische Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA. Die Bezeichnung "Mini-" stammt von der minimalen Menge mit denen gearbeitet wird. Es gibt nämlich auch die Midi- oder Maxi-Präp mit größeren Volumina.
-**Lösungen für die Minilysatpräparation von Plasmid DNA**
+Im OLGA gibt es ein fix fertiges DIY MiniPräp Kit mit den Lösungen und der Anleitung. Dieses kann/darf/soll ein jeder benutzen.
+[[https://galley.realraum.at/_data/i/upload/2018/12/01/20181201172452-90210fd6-me.jpg|{{https://galley.realraum.at/_data/i/upload/2018/12/01/20181201172452-90210fd6-me.jpg?300x500}}]]
+==== Lösungen für die Minilysatpräparation von Plasmid DNA ====
 **Lösung I:** (400 µL)
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 **Ethanol: 70%** (800 µL)
+**ddH20 (Fresenius Wasser, DNase-freies Wasser)** (20-50 µL]
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-Rätsel:
+==== Rätsel ====
 Tubes mit den Lösungen I, II & III liegen vor einem. Die Beschriftung ist nicht mehr erkennbar. Wie kann man trotzdem feststellen, um welche Lösungen es sich handelt OHNE die Lösungen zu entnehmen?
 ) Riechen: Lösung III riecht nach Essig wegen KAc.
 ) Schütteln: Lösung II bildet Schaum wegen SDS.
 ) Lösung 1 bleibt übrig.
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+==== Durchführung: ====
+. Bakterien werden aus 3 ml ONC geerntet. Dazu 1,5 ml ONC in ein Eppendorfgefäß
+(Eppi) füllen und 1 min x 10,000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugieren. Entfernen
+des Überstands. Erneut 1,5 ml ONC in Eppi füllen und Zentrifugation wiederholen.
+Entfernen des Überstands.
+. Resuspendieren des Zellpellets in 400 µl Lösung I (4°C). Das Pellet muss vollständig
+resuspendiert werden.
+. Zugabe von 400 µl Lösung II, vorsichtig mischen (kippen) und 5 min bei Raumtemperatur
+inkubieren. Die Lösung im Eppi wird klar und zäh.
+. Zugabe von vorgekühlter (Eis!) 400 µl 2,8M Kaliumacetatlösung, pH 5,1 und gut mischen
+(kippen/ invertieren), aber nicht vortexen! Es entsteht ein weißer, flockiger Niederschlag.
+Das Eppi 15 min auf Eis stellen.
+. 10 min bei höchster Umdrehung in der Tischzentrifuge zentrifugieren.
+. ca. 800 µl Überstand wird ohne Flocken in ein frisches Eppi überführt, mit 600 µl
+Isopropanol gemischt (kippen/ invertieren), aber nicht vortexen!
+. Zentrifugation für 15 Minuten bei 4°C und 10.000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge), um DNA
+zu pelletieren. Der Überstand wird entfernt und das Pellet mit 800 µl eiskaltem 70%-
+igen Ethanol gewaschen. Zentrifugation für 15 min siehe oben. Der Überstand wird
+vollständig entfernt und das Pellet luftgetrocknet (offener Deckel).
+Optional: Trocknen mit offenem Deckel bei 37°C für 10-15 Minuten.
+. Das Pellet in 20 µl H20 lösen.
+. 3 µl der gelösten Plasmid DNA werden in ein neues Eppi überführt und für nachfolgende
+Schnitt-Kontrollen bei -20°C gelagert. Eppi gut beschriften!
+. 15µl der restlichen Plasmid DNA für den Restriktionsansatz verwenden und die
+verbleibende Plasmid DNA bei -20°C aufbewahren. Eppis gut beschriften!
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+Quellenangabe:
+"Molekularbiologische Übungen 1" Skriptum 2012, Institut für Molekulare Biowissenschaften, Karl-Franzens Universität Graz

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