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--- olga:olgaloesungengramfaerbung [2020-04-09 13:05]
danield [Theoretischer Hintergrund]
+++ olga:olgaloesungengramfaerbung [2020-06-25 20:10] (current)
danield
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 Eine **Abschwächung der Färbung** erreicht man durch Behandlung des zu stark gefärbten Präparats mit
-- 70-96%igem Ethanol
+- 70-96 %igem Ethanol
 - Aceton
-- 0,5 - 1%iger Essigsäure
+- 0,5 - 1 %iger Essigsäure
 - verdünnter Salzsäure
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  Es sind einige Farbstoffe bekannt, die speziell für die Mikroskopie eingesetzt werden. Von diesen Farbstoffen wird zuerst eine alkoholische **Stammlösung** hergestellt, manche lassen sich auch in Wasser lösen.
-Erst unmittelbar vor Gebrauch einer Lösung wird die **Gebrauchslösung** hergestellt. Dabei wird ein Teil der Stammlösung ausreichend mit einem geeignetem Lösungsmittel (meist dH20, je nach Farbstoff auch andere wässrige Reagenzlösungen) verdünnt. Hinweis, in der Stammlösung befindet sich unlöslicher Niederschlag, aufpassen beim überführen (pipettieren, gießen) ansonsten die Gebrauchslösung im Papierfilter abfiltrieren, die Lösung muss klar sein.
+Erst unmittelbar vor Gebrauch einer Lösung wird die **Gebrauchslösung** hergestellt. Dabei wird ein Teil der Stammlösung ausreichend mit einem geeignetem Lösungsmittel (meist dH20, je nach Farbstoff auch andere wässrige Reagenzlösungen) verdünnt. Hinweis, in der Stammlösung befindet sich unlöslicher Niederschlag, aufpassen beim Überführen (pipettieren, gießen), ansonsten die Gebrauchslösung im Papierfilter abfiltrieren, die Lösung muss klar sein.
-Die Gebrauchslösung füllt man am besten in 20-30 mL Tropffläschchenaus Polyethylen, die einen Tropfverschluss mit langer Spitze und Verschlusskappe besitzen. Fläschchen aus Glas mit Schliff oder Pipetten mit Gummisauger sind weniger gut geeignet, weil der Schliff schnell mit Farbstoffresten verkrustet und die Flasche dann oft schwer zu öffnen ist.
+Die Gebrauchslösung füllt man am besten in 20-30 mL Tropffläschchen aus Polyethylen, die einen Tropfverschluss mit langer Spitze und Verschlusskappe besitzen. Fläschchen aus Glas mit Schliff oder Pipetten mit Gummisauger sind weniger gut geeignet, weil der Schliff schnell mit Farbstoffresten verkrustet und die Flasche dann oft schwer zu öffnen ist.
 Aufbewahrt werden die Gebrauchslösungen bei Raumtemperatur (15-20°C) und vor Licht geschützt, man halte sie vor Ammoniak und Säuren fern. Je nach Farbstoff sind die Lösungen einige Tage bis etwa ein Jahr haltbar. Bei niedrigen Temperaturen (<15°C) entsteht ein Niederschlag, der die Färbung stört. Vor Gebrauch kann man die Lösung in ein 60°C warmes Wasserbad stellen um den größten Teil der Niederschlags zu lösen, ansonsten filtrieren.
-Da die Färbemittel sehr intensiv färben, auch Haut, Kleidung, Oberflächen, sollte man Handschuhe und einen Labormantel verwenden, um sich vor Farbspritzern zu schützen. Zum Schutz der Arbeitsoberflächen bitten wir euch darum **NUR INNERHALB** der Gramfärbebox zu färben. Der aufgeschnittene Plastikkontainer und die metallene Objekträgerhalterung dient als DIY Färbebank.
+Da die Färbemittel sehr intensiv färben, auch Haut, Kleidung, Oberflächen, sollte man Handschuhe und einen Labormantel verwenden, um sich vor Farbspritzern zu schützen. Zum Schutz der Arbeitsoberflächen bitten wir euch darum, **NUR INNERHALB** der Gramfärbebox zu färben. Der aufgeschnittene Plastikkontainer und die metallene Objekträgerhalterung dienen als DIY-Färbebank.
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 ==== Praxis ====
-** - Im OLGA verwendete Farbstoffe für Stammlösungen**
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+** - Stammlösungen (im OLGA)**
-|Kristallviolett|1,68 g|in 100 mL H20|
 |Methylenblau|1,48 g|in 100 mL EtOH (96%)|
+|Kristallviolett|1,68 g|in 100 mL H20|
 |Safranin|3,41 g|in 100 mL EtOH (96%)|
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 ** - Ansetzen einer gesättigten alkoholischen Farbstoffstammlösung**
 Material:
-| kationischen Farbstoff | 100 mL 96&iges (w/w) Ethanol | braune Schraubverschlussflasche | Wasserbad bei ~50°C | Laborwaage |
+| kationischen Farbstoff | 100 mL 96%iges (w/w) Ethanol | braune Schraubverschlussflasche | Wasserbad bei ~50°C | Laborwaage |
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+** - Färbung mit Methylenblau**
+Methylenblaufärbung liefert klare, strukturreiche Bilder, hat eine hohe Affinität zu Polyphosphatgranula, jedoch lassen sich manche Bakterien nur schwach oder gar nicht damit anfärben (viele aber schon!)
+**Lösungen:**
+__Alkalische Methylenblaulösung nach Löffler:__
+|Lösung A:|Methylenblaustammlösung|30 mL|
+|Lösung B:|0,01 %ige (w/v) Kalilauge|100 mL|
+Lösung A unter Rühren zu Lösung B geben.
+**Verwendung**
+- den fixierten Bakterienausstrich vollständig mit alkalischer Methylenblaulösung bedecken.
+- Farbstoff etwa 30 Sekunden einwirken lassen.
+- Färbelösung abgießen und Ausstrich kurz mit Wasser spülen (Wasserstrahl nicht direkt auf Ausstrich).
+**Auswertung:**
+Die Bakterienzellen sind blau gefärbt. Polyphosphatgranula erscheinen bläulichpurpurn bis violett.
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+** - Färbung mit Kristallviolett**
+Die Färbung mit Kristallviolett macht auch schwach anfärbbare Bakterien gut sichtbar. Der Farbstoff neigt jedoch zum Überfärben und in proteinreichen Material zu Ausfällungen.
+**Lösungen:**
+__Ammoniumoxalat-Kristallviolett-Lösung nach Hucker:__
+|Lösung A:|Kristallviolettstammlösung|20 mL|
+|Lösung B:|Ammoniumoxalat-Monohydrat|0,8 g|
+| |destilliertes Wasser|80 mL|
+Lösung A unter Rühren zu Lösung B geben.
+**Verwendung**
+- den fixierten Bakterienausstrich vollständig mit Färbelösung bedecken.
+- Farbstoff nur 10 Sekunden lang einwirken lassen.
+- Färbelösung abgießen und Ausstrich kurz mit Wasser spülen (Wasserstrahl nicht direkt auf Ausstrich).
+**Auswertung:**
+Die Bakterienzellen sind kräftig blauviolett gefärbt.
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