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olga:projekte_dna_analyse [2014-02-10 19:49] humpel |
olga:projekte_dna_analyse [2015-09-23 02:06] (current) xro |
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Line 6: | Line 6: | ||
**Protokolle:**{{:olga:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf|}} | **Protokolle:**{{:olga:human_dna_fingerprinting_protocol.pdf|}} | ||
- | **Vorbereitungen:** Mix aus 9 RAPD Primern hergestellt | ||
+ | \\ | ||
+ | |||
+ | === Zellen sammeln und auflösen:=== | ||
Line 15: | Line 17: | ||
-5min bei 4000rpm zentrifugieren | -5min bei 4000rpm zentrifugieren | ||
+ | |||
-Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet | -Die Zellen sammeln sich am Boden, die Flüssigkeit wird weggeschüttet | ||
-Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen ((50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS)) | -Zellen in 400µl Lysis Buffer auflösen ((50 mM TRIS-Cl pH 8, 10 mM EDTA, 2% SDS)) | ||
Line 20: | Line 23: | ||
*60mg SDS hinzufügen. | *60mg SDS hinzufügen. | ||
*Davon dann 400µl nehmen. | *Davon dann 400µl nehmen. | ||
+ | |||
-5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad) | -5 Minuten auf 65° aufheizen (Wasserbad) | ||
- | Magnetische Dna Beads vorbereiten: | + | === Magnetische Dna Beads vorbereiten: === |
-Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen | -Magnetische Beads mit 1ml destilliertem Wasser in Microtube mischen | ||
+ | |||
-Magnet an die Seite des Microtubes halten | -Magnet an die Seite des Microtubes halten | ||
+ | |||
-60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind | -60 Sekunden warten, bis alle Beads an der Wand gesammelt sind | ||
+ | |||
-Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen | -Wasser mit Pipette absaugen und Waschvorgang 3x mit frischen Wasser wiederholen | ||
+ | |||
-Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen | -Beads mit 50µl destilliertem Wasser mischen und vortexen | ||
- | DNA ausfällen, an Beads binden, waschen: | + | |
+ | === DNA ausfällen, an Beads binden, waschen: === | ||
-400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben | -400µl einer 70% Isopropanol Lösung zum Microtube mit den Zellen geben | ||
+ | |||
-Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen | -Beads-Lösung und Zell-Lösung mischen | ||
+ | |||
-2-10 Minuten warten | -2-10 Minuten warten | ||
+ | |||
-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden. | -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden. | ||
+ | |||
-Flüssigkeit absaugen | -Flüssigkeit absaugen | ||
+ | |||
-800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen | -800µl 70% Isopropanol zu den Beads hinzufügen, 10 Sekunden vortexen | ||
+ | |||
-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen | -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, Isopropanol absaugen | ||
+ | |||
-Waschvorgang midnestens 2x wiederholen | -Waschvorgang midnestens 2x wiederholen | ||
- | DNA in Lösung bringen: | + | === DNA in Lösung bringen: === |
-20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen | -20-200µl destilliertes Wasser oder TAE Puffer hinzufügen | ||
+ | |||
-2-10 minuten warten, mehrmals mischen | -2-10 minuten warten, mehrmals mischen | ||
+ | |||
-Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden | -Beads mit Magnet an Microtube Wand sammeln, 30-60 Sekunden | ||
+ | |||
-Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube | -Flüssigkeit mit gelöster DNA absaugen und in neue Microtube | ||
- | DNA einfärben(optional): | + | === DNA einfärben(optional): === |
-zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2) | -zu 500µl DNA Löung 50µl Natriumacetat geben (3 M, pH 5,2) | ||
+ | |||
-Vortexen | -Vortexen | ||
+ | |||
-Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA | -Zusatz von 6 μl (30 μg) Fällungszusatz Roti PinkDNA | ||
+ | |||
-Vortexen | -Vortexen | ||
+ | |||
-Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70% | -Zusatz von 1 Volumina Isopropanol 70% | ||
+ | |||
-Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. | -Inkubation bei Raumtemperatur für 10 min. | ||
+ | |||
-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. | -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. | ||
+ | |||
-Überstand sorgfältig abnehmen | -Überstand sorgfältig abnehmen | ||
+ | |||
-Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol | -Waschen des Pellets mit ca. 1 Vol. 70 % Isopropanol | ||
+ | |||
-Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. | -Zentrifugation bei 13.000 rpm für 10 min. | ||
+ | |||
-Überstand sorgfältig abnehmen | -Überstand sorgfältig abnehmen | ||
- | -Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln | + | |
- | (ca. 10 sec.) | + | -Anzentrifugieren des Pellets, um das restliche Ethanol in der Spitze des Röhrchens zu sammeln (ca. 10 sec.) |
-Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen | -Restlichen Überstand sorgfältig abnehmen | ||
+ | |||
-Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.) | -Trocknen des Pellets bei Raumtemperatur (ca. 3 min.) | ||
- | -Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles | + | |
- | Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer) | + | -Resuspendieren in geeigentem Puffer (steriles Wasser, 10 mM Tris-Puffer, TE-Puffer) |
- | PCR: | + | === PCR: === |
-2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen | -2µM Primer (2µl), 25µl OneTaq 2x Mastermix und 23µl DNA Lösung mischen | ||
+ | |||
-30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen | -30 Zyklen, jeweils ca. 1 Minute pro Temperaturschritt im Thermocycler durchlaufen lassen | ||
- | Gel-Elektrophorese: | + | === Gel-Elektrophorese: === |
Line 90: | Line 128: | ||
-in Kammer gießen | -in Kammer gießen | ||
+ | |||
-Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen | -Gel aushärten lassen und Kammer mit 1x TAE Puffer füllen | ||
+ | |||
-DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen | -DNA Lösung, Ladepuffer und DNA Farbstoff mischen | ||
+ | |||
-Box anschließen und laufen lassen | -Box anschließen und laufen lassen | ||
+ | {{tag>project olga dna pcr}} |
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