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Stammlösungen in der Mikroskopie
Theoretischer Hintergrund
Zur Untersuchung von fixierten Bakterien (auf einem Objektträger) unter dem Mikroskop können diese mit Farbstoffen gefärbt werden. Die Anfärbung von Bakterien kann verschiedenen Zwecken dienen:
1) Es dient dem erhöhten Kontrast durch einheitliches, unspezifisches Anfärben der Zellen, um sie besser sichtbar zu machen, ohne die Auflösung zu verringern = einfache Färbung
2) Unterscheidung / Differenzierung verschiedener Bakteriengruppen = Differentialfärbung
3) Selektive Darstellung bestimmter Zellstrukturen oder Zelleinschlüsse (Geißeln, Sporen oder Reservestoffe) = “cytologische” Färbung
Bakterien färbt man klassischerweise mit kationischen (basischen) Farbstoffen. Die Farbstoffkationen reagieren beim Färben mit negativ geladenen (sauren) Gruppen von Zellbestandteilen wie z.B. Carboxygruppen von Proteinen oder Phosphatgruppen von Nucleinsäuren.
Eine Vertiefung der Färbung lässt sich erzielen durch
- längere Einwirkungsdauer des Farbstoffs
- Erhöhung der Temperatur während der Einwirkung
- Zusatz gewisser Stoffe, wie Laugen oder Phenol
Eine Abschwächung der Färbung erreicht man durch Behandlung des zu stark gefärbten Präparats mit
- 70-96 %igem Ethanol
- Aceton
- 0,5 - 1 %iger Essigsäure
- verdünnter Salzsäure
Es sind einige Farbstoffe bekannt, die speziell für die Mikroskopie eingesetzt werden. Von diesen Farbstoffen wird zuerst eine alkoholische Stammlösung hergestellt, manche lassen sich auch in Wasser lösen.
Erst unmittelbar vor Gebrauch einer Lösung wird die Gebrauchslösung hergestellt. Dabei wird ein Teil der Stammlösung ausreichend mit einem geeignetem Lösungsmittel (meist dH20, je nach Farbstoff auch andere wässrige Reagenzlösungen) verdünnt. Hinweis, in der Stammlösung befindet sich unlöslicher Niederschlag, aufpassen beim Überführen (pipettieren, gießen), ansonsten die Gebrauchslösung im Papierfilter abfiltrieren, die Lösung muss klar sein.
Die Gebrauchslösung füllt man am besten in 20-30 mL Tropffläschchen aus Polyethylen, die einen Tropfverschluss mit langer Spitze und Verschlusskappe besitzen. Fläschchen aus Glas mit Schliff oder Pipetten mit Gummisauger sind weniger gut geeignet, weil der Schliff schnell mit Farbstoffresten verkrustet und die Flasche dann oft schwer zu öffnen ist.
Aufbewahrt werden die Gebrauchslösungen bei Raumtemperatur (15-20°C) und vor Licht geschützt, man halte sie vor Ammoniak und Säuren fern. Je nach Farbstoff sind die Lösungen einige Tage bis etwa ein Jahr haltbar. Bei niedrigen Temperaturen (<15°C) entsteht ein Niederschlag, der die Färbung stört. Vor Gebrauch kann man die Lösung in ein 60°C warmes Wasserbad stellen um den größten Teil der Niederschlags zu lösen, ansonsten filtrieren.
Da die Färbemittel sehr intensiv färben, auch Haut, Kleidung, Oberflächen, sollte man Handschuhe und einen Labormantel verwenden, um sich vor Farbspritzern zu schützen. Zum Schutz der Arbeitsoberflächen bitten wir euch darum, NUR INNERHALB der Gramfärbebox zu färben. Der aufgeschnittene Plastikkontainer und die metallene Objekträgerhalterung dienen als DIY-Färbebank.
Praxis
- Stammlösungen (im OLGA)
| Methylenblau | 1,48 g | in 100 mL EtOH (96%) |
| Kristallviolett | 1,68 g | in 100 mL H20 |
| Safranin | 3,41 g | in 100 mL EtOH (96%) |
- Ansetzen einer gesättigten alkoholischen Farbstoffstammlösung
Material:
| kationischen Farbstoff | 100 mL 96%iges (w/w) Ethanol | braune Schraubverschlussflasche | Wasserbad bei ~50°C | Laborwaage |
Durchführung:
- die entsprechende Menge des kationischen Farbstoffes in die braune Schraubverschlussflasche einwiegen und mit 100 mL 96%igem Ethanol übergießen, das vorher im Wasserbad erwärmt wurde.
- Mehrmals kräftig schütteln.
-Den Ansatz für 2-3 Tage lichtgeschützt bei Raumtemperatur stehen lassen, wiederholt kräftig schütteln. Es bleibt ein unlöslicher Niederschlag am Boden zurück (aufpassen beim Überführen).
- Stammlösung ist gut verschlossen in der braunen Flasche bei Raumtemperatur und vor Licht geschützt jahrelang haltbar (Lagerung im Chemikalienschrank!).
- Färbung mit Methylenblau
Methylenblaufärbung liefert klare, strukturreiche Bilder, hat eine hohe Affinität zu Polyphosphatgranula, jedoch lassen sich manche Bakterien nur schwach oder gar nicht damit anfärben (viele aber schon!)
Lösungen:
Alkalische Methylenblaulösung nach Löffler:
| Lösung A: | Methylenblaustammlösung | 30 mL |
| Lösung B: | 0,01 %ige (w/v) Kalilauge | 100 mL |
Lösung A unter Rühren zu Lösung B geben.
Verwendung
- den fixierten Bakterienausstrich vollständig mit alkalischer Methylenblaulösung bedecken.
- Farbstoff etwa 30 Sekunden einwirken lassen.
- Färbelösung abgießen und Ausstrich kurz mit Wasser spülen (Wasserstrahl nicht direkt auf Ausstrich).
Auswertung:
Die Bakterienzellen sind blau gefärbt. Polyphosphatgranula erscheinen bläulichpurpurn bis violett.
- Färbung mit Kristallviolett
Die Färbung mit Kristallviolett macht auch schwach anfärbbare Bakterien gut sichtbar. Der Farbstoff neigt jedoch zum Überfärben und in proteinreichen Material zu Ausfällungen.
Lösungen:
Ammoniumoxalat-Kristallviolett-Lösung nach Hucker:
| Lösung A: | Kristallviolettstammlösung | 20 mL |
| Lösung B: | Ammoniumoxalat-Monohydrat | 0,8 g |
| destilliertes Wasser | 80 mL |
Lösung A unter Rühren zu Lösung B geben.
Verwendung
- den fixierten Bakterienausstrich vollständig mit Färbelösung bedecken.
- Farbstoff nur 10 Sekunden lang einwirken lassen.
- Färbelösung abgießen und Ausstrich kurz mit Wasser spülen (Wasserstrahl nicht direkt auf Ausstrich).
Auswertung:
Die Bakterienzellen sind kräftig blauviolett gefärbt.
Quellenverzeichnis:
Bast, Eckard; “Mikrobiologische Methoden: eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken”, 2. Auflage - Heidelberg; Berlin: Spektrum, Akad. Verl. 2001