Die Plasmidpräparation (auch Plasmidisolierung) ist eine molekularbiologische Methode zur Isolierung von Plasmid-DNA. Die Bezeichnung “Mini-” stammt von der minimalen Menge mit denen gearbeitet wird. Es gibt nämlich auch die Midi- oder Maxipräp mit größeren Volumina.

Im OLGA gibt es einfertiges DIY-Minipräp-Kit mit den Lösungen und der Anleitung. Dieses kann/darf/soll ein jeder benutzen.

Lösung I: (400 µL)

50 mM Tris/HCl pH 8

10 mM EDTA pH 8; autoklavieren

Zugabe von 100 µg RNAseA /ml

Lösung II: (400 µL)

0.2 M NaOH;

1% (w/v) SDS

Lösung III: (400 µL)

2,8 M KAc; einstellen auf pH 5,1

Isopropanol: 99% (800 µL)

Ethanol: absolute (800 µL)

Ethanol: 70% (800 µL)

ddH20 (Fresenius Wasser, DNase-freies Wasser) (20-50 µL]

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3 Tubes mit den Lösungen I, II & III liegen vor einem. Die Beschriftung ist nicht mehr erkennbar. Wie kann man trotzdem feststellen, um welche Lösungen es sich handelt OHNE die Lösungen zu entnehmen?

1) Riechen: Lösung III riecht nach Essig wegen KAc.

2) Schütteln: Lösung II bildet Schaum wegen SDS.

3) Lösung 1 bleibt nach Ausschlussverfahren übrig.

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1. Bakterien werden aus 3 ml ONC geerntet. Dazu 1,5 ml ONC in ein Mikroreaktionsgefäß (Eppi) füllen und 1 min x 10,000 rpm in der Tischzentrifuge zentrifugieren. Entfernen des Überstands. Erneut 1,5 ml ONC in Eppi füllen und Zentrifugation wiederholen. Entfernen des Überstands.

2. Resuspendieren des Zellpellets in 400 µl Lösung I (4°C). Das Pellet muss vollständig resuspendiert werden.

3. Zugabe von 400 µl Lösung II, vorsichtig mischen (kippen) und 5 min bei Raumtemperatur inkubieren. Die Lösung im Eppi wird klar und zäh.

4. Zugabe von vorgekühlter (Eis!) 400 µl 2,8M Kaliumacetatlösung, pH 5,1 und gut mischen (kippen/invertieren), aber nicht vortexen! Es entsteht ein weißer, flockiger Niederschlag. Das Eppi 15 min auf Eis stellen.

5. 10 min bei höchster Umdrehung in der Tischzentrifuge zentrifugieren.

6. ca. 800 µl Überstand wird ohne Flocken in ein frisches Eppi überführt, mit 600 µl Isopropanol gemischt (kippen/invertieren), aber nicht vortexen!

7. Zentrifugation für 15 Minuten bei 4°C und 10.000 rpm (Eppendorf-Zentrifuge), um DNA zu pelletieren. Der Überstand wird entfernt und das Pellet mit 800 µl eiskaltem 70%- igen Ethanol gewaschen. Zentrifugation für 15 min siehe oben. Der Überstand wird vollständig entfernt und das Pellet luftgetrocknet (offener Deckel). Optional: Trocknen mit offenem Deckel bei 37°C für 10-15 Minuten.

8. Das Pellet in 20 µl H20 lösen.

9. 3 µl der gelösten Plasmid DNA werden in ein neues Eppi überführt und für nachfolgende Schnittkontrollen bei -20°C gelagert. Eppi gut beschriften!

10. 15µl der restlichen Plasmid-DNA für den Restriktionsansatz verwenden und die verbleibende Plasmid DNA bei -20°C aufbewahren. Eppis gut beschriften!

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Quellenangabe:

“Molekularbiologische Übungen 1” Skriptum 2012, Institut für Molekulare Biowissenschaften, Karl-Franzens Universität Graz