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Gram Färbung von Bakterien (Differentialfärbung)
Theoretischer Hintergrund
Die Gramfärbung wurde 1884 von dem dänischen Pathologen und Bakteriologen H.C.J. Gram durch Zufall entdeckt und ist die wichtigste Differentialfärbung in der Bakteriendiagnostik. Grundlegend für die bakterielle Klassifikation macht es sie zur wichtigsten mikrobiologischen Färbemethode überhaupt und sollte von allen MikrobiologInnen in Theorie, als auch in Praxis beherrscht werden.
Bei unbekannten Bakterienisolaten ermöglicht die Gramfärbung eine erste Einteilung in zwei große Gruppen, die grampositiven und die gramnegativen Bakterien, die sich im Aufbau ihrer Zellwand (und weiteren Eigenschaften wie z.B. Empfindlichkeit gegenüber Antibiotika) unterscheiden.
| Gramfärbung umfasst 4 Schritte: 1) Kristallviolett Färbung 2) Beizen mit Lugol'scher Lösung (Jod-Kalium-Jodid) 3) Entfärbung durch Ethanol Behandlung (Differenzierung) 4) Gegenfärbung mit Safranin Nach der Differenzierung sind grampositive Zellen violett und gramnegative Zellen rot gefärbt. |  |
Vergleichsorganismen:
Als Kontrolle werden Vergleichsorganismen bekannter Bakterien verwendet, wenn man das Gramverhalten von unbekannten Organismen ermitteln möchte.
| Grampositiv | Bacillus subtilis, Lactobacillus spp. |
| Gramnegativ | E. coli K12, Pseudomonas fluorescens |
Verwendete Lösungen für Gramfärbung
1) Ammoniumoxalat-Kristallviolett-Lösung nach Hucker (siehe hier Stammösungen in Mikroskopie - Praxis - Färbung mit Kristallviolett) = 1. Färbemittel
2) Lugol'sche Lösung (Jod-Kalium-Jodid) = Beizmittel
DIY:
| Jod | 1 g |
| Kalium-Jodid | 2 g |
| dH20 | 300 mL |
Lagerbar in brauner Flasche
3) 96 %iges Ethanol = Entfärbemittel
Für schnellere Entfärbung kann eine EtOH:Aceton = 1:1 (v/v) Lösung erstellt werden.
4) Safranin Lösung = Gegenfärbung mit 2. Färbemittel
| Safranin Stammlösung (siehe hier Stammösungen in Mikroskopie - Praxis - Stammösungen) | 10 mL |
| dH20 | 100 mL |
Praktische Durchführung
Es wird empfohlen mit Handschuhen, Labormantel und eventuell Schutzbrille zu arbeiten (fiese Flecken und nicht ungefährliche Lösungsmittel –> Schädlich für aquatische Organismen, auf keinen Fall in den Abguss!)
Es darf NUR INNERHALB der Gramfärbebox gefärbt werden. Dafür den Hitze fixierten Objekträger in die metallene Halterung einspannen und diese in den aufgeschnittenen Plastikkanister stellen. In dieser DIY Färbebank werden ablaufende Färbemittel aufgefangen. Nach Beendigung der Gramfärbung werden die Flüssigkeiten mithilfe des beiliegenden Plastik Trichters in die verschließbare WASTE Flasche überführt. Ist diese voll –> neue Flasche verwenden und Volle zur sicheren Entsorgung der Feuerwehr am Dietrichsteinplatz bringen.
Anleitung:
1) Bakterien auf Objekträger Hitze fixieren.
2) Bakterien mit Kristallviolett-Lösung vollständig bedecken
1 Minute einwirken lassen
3) Kristallviolett-Lösung abgießen (Schrägstellung)
4) Objekträger schräg lassen. Durch Auftropfen von Lugol'scher Lösung waschen.
5) Objekträger gerade legen. Ganz mit Lugol'scher Lösung bedecken.
1 Minute einwirken lassen
6) Objekträger schräg halten. Von oben maximal 10 Sekunden lang 96 %iges Ethanol tropfenweise verteilt laufen lassen bis das abtropfende EtOH klar bzw. farblos ist.
7) Sofort mit dH20 spülen.
8) Objekträger gerade legen. Bakterien vollständig mit Safranin-Lösung bedecken.
1 Minute einwirken lassen
9) Safranin abgießen.
10) Objekträger vorsichtig mit dH20 abspülen, bis keine Farbe mehr abläuft.
11) Mikroskopieren :)
Auswertung:
| Grampositive Bakterien sind dunkelblau bis tiefviolett gefärbt. Gramnegative Bakterien sind orange bis hellrot gefärbt. |  |
Quellenverzeichnis:
Bast, Eckard; “Mikrobiologische Methoden: eine Einführung in grundlegende Arbeitstechniken”, 2. Auflage - Heidelberg; Berlin: Spektrum, Akad. Verl. 2001